Consejos básicos para la criopreservación de cultivos celulares

Consejos básicos para la criopreservación de cultivos celulares

Las células continúan su metabolismo durante las actividades normales de crecimiento, lo que requiere la participación de varias proteasas. Cuando la temperatura cae por debajo de -70 ° C, las proteasas dejan de funcionar. Por lo tanto, en un entorno con temperaturas extremadamente bajas, las células pueden detener sus actividades metabólicas y ingresar a un estado inactivo que permite el almacenamiento a largo plazo.

1. Materiales experimentales

Material de base:

Medio de cultivo básico

Sero (FBS/NBS convencional)

Banco de trabajo ultrapure

Dimetil sulfóxido estéril (DMSO)

Solución salina de tampón fosfato PBS estéril

Pistola

Pistola eléctrica

Preparación de los experimentos

a) Preparación de la solución de congelación:

Células generales: 55% de medio basal + 40% de suero bovino (FBS/NBS) + 5% DMSO

Células vitales: suero bovino al 90% (FBS/NBS) + 10% DMSO

Aliquot, la solución de criopreservación preparada en un tubo de centrífuga de 15 ml [nido] y almacene a 4 ° C para su uso posterior.

(b) Preparación de células para congelarse:

Antes de congelar las células, seleccione las células con buen estado de crecimiento y en la fase de crecimiento logarítmica y reemplácelas con medio fresco de 12-24 horas antes de congelar para mantener la condición celular.

2. Procedimiento experimental

1. Observe la densidad de las células a congelarse, que es de aproximadamente el 80%~ 90%. Use una pistola de pipeta para aspirar el medio viejo, agregue PBS estéril para lavar las células 1-2 veces y retire el medio restante en el entorno de cultivo.

2. Agregue una cantidad apropiada de tripsina o jugo digestivo para permitir que la tripsina ingrese a las celdas y colóquelas en la incubadora para la digestión. Observe la condición de las células bajo el microscopio: el citoplasma se retrae y las células ya no están conectadas a láminas. En este punto, agregue la solución de parada para detener el proceso de digestión.

3. Burbujee suavemente las células con una punta para formar una suspensión celular y centrifugarse la suspensión celular a 1000 rpm durante 3-5 minutos.

Deseche el sobrenadante, agregue una cantidad adecuada de solución de congelación y pipeta suavemente para que las células cuenten de manera uniforme. Ajuste la densidad celular con medio de criopreservación para hacer la densidad final 5 × 106/ml ~ 1 × 107/ml.

4. Use una pistola de pipeta para separar los tubos criogénicos de acuerdo con la capacidad esperada y use una máquina de limitación automática para taparse y sellar.

5. El programa de criopreservación estándar es una velocidad de enfriamiento de -1 ° C a -2 ° C/min, y las células a congelar pueden congelarse gradualmente de acuerdo con los siguientes pasos: temperatura ambiente → 4 ° C (20 min) → - - - - - - - 20 ° C (30 minutos) → -80 ° C ° C (durante la noche) → Almacenamiento a largo plazo en nitrógeno líquido.

También se puede almacenar directamente en un congelador a -80 ° C durante la noche y luego transferirse al nitrógeno líquido para el almacenamiento.

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